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激光共聚焦顯微鏡的工作原理介紹

更新時間:2022-06-27      點(diǎn)擊次數(shù):4530
   激光共聚焦顯微鏡是一種先進(jìn)的細(xì)胞和分子生物學(xué)分析儀器,已被激光,電子照相機(jī)和計算機(jī)圖像處理等現(xiàn)代高科技手段所滲透,并與傳統(tǒng)的光學(xué)顯微鏡相結(jié)合。它以激光為光源,采用共軛聚焦原理和裝置,并使用計算機(jī)對觀察對象進(jìn)行數(shù)字圖像處理觀察,分析和輸出。它的特征是對樣品進(jìn)行斷層掃描和成像,對細(xì)胞的三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行非侵入式觀察和分析。同時,使用免疫熒光標(biāo)記和離子熒光標(biāo)記探針,該技術(shù)不僅可以觀察固定的細(xì)胞和組織切片,還可以實時動態(tài)觀察和檢測活細(xì)胞的結(jié)構(gòu),分子,離子和生命活動。它越來越多地用于生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域,已經(jīng)成為生物醫(yī)學(xué)實驗研究中重要的工具。
  激光共聚焦顯微鏡也是活細(xì)胞的動態(tài)觀察、多重免疫熒光標(biāo)記和離子熒光標(biāo)記觀察的有力工具。不僅可對活的或固定的細(xì)胞及組織進(jìn)行無損傷的“光學(xué)切片”,進(jìn)行單標(biāo)記或雙標(biāo)記細(xì)胞及組織標(biāo)本的熒光定性定量分析;還可以用于活細(xì)胞生理信號,離子含量的實時動態(tài)分析監(jiān)測,粘附細(xì)胞的分選,細(xì)胞激光顯微外科和光陷阱技術(shù)等??梢詿o損傷的觀察和分析細(xì)胞的三維空間結(jié)構(gòu)。
  激光共聚焦顯微鏡的原理是用點(diǎn)光源照射試樣,在焦平面上形成輪廓清晰的小光斑。光斑照射后發(fā)出的熒光被物鏡收集,沿原照射光路送回由雙向色鏡組成的分光鏡。光譜儀將熒光直接發(fā)送到檢測器。光源和探測器前面有一個針孔,分別稱為照明針孔和檢測針孔。兩者的幾何尺寸相同,約100-200納米;與焦平面上的光斑相比,兩者是共軛的,即光斑可以通過一系列透鏡同時聚焦在照明針孔和檢測針孔上。這樣,來自焦平面的光可以會聚在檢測孔范圍內(nèi),而來自焦平面上方或下方的散射光被阻擋在檢測孔之外而無法成像。激光逐點(diǎn)掃描樣本,檢測到針孔后的光電倍增管也逐點(diǎn)獲得相應(yīng)光點(diǎn)的共焦圖像,將其轉(zhuǎn)化為數(shù)字信號傳輸至計算機(jī)。整個焦平面的清晰共焦圖像聚集在屏幕上。
  每個焦平面圖像實際上是樣品的光學(xué)橫截面,這種光學(xué)截面總是具有一定的厚度,也稱為光學(xué)片。由于焦點(diǎn)處的光強(qiáng)遠(yuǎn)大于非焦點(diǎn)處的光強(qiáng),且非焦平面光被針孔過濾,因此共焦系統(tǒng)的景深近似為零。沿z軸掃描可實現(xiàn)光學(xué)斷層掃描,并在待觀察樣品的焦斑處形成二維光學(xué)切片。將X-Y平面(焦平面)掃描與z軸(光軸)掃描相結(jié)合,將連續(xù)層次的二維圖像進(jìn)行累加,經(jīng)專用計算機(jī)軟件處理,即可得到樣品的三維圖像。即檢測針孔和光源針孔始終聚焦在同一點(diǎn)上,使得聚焦平面外激發(fā)的熒光無法進(jìn)入檢測針孔。
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